第七章 封閉（Blocking）

   第七章 封閉（Blocking）

   雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)來(lái)降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。zui常見的封閉劑是 BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。

5%脫脂奶粉或 BSA（室溫孵育 1 h）

Western Blot 膜封閉液

Tween-20 的作用：Tween-20 是一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí)別能力。在做 westen blot 時(shí)，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時(shí)，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如 SDS 則破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。

封閉劑選擇的特殊情況：

脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼亍?/span>如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。檢測(cè)磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。

一般封閉條件為：

    室溫或者 37℃緩慢搖蕩 1～2 h，特殊情況也可 4℃封閉一夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。